Nieprawidłowe receptory interleukiny 1 w wydzielającym kortyzę gruczolaku nadnerczy powodującym zespół Cushinga ad

Obecność białka interleukiny-1 oceniono przez immunobarwienie dwoma mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko receptory interleukiny typu I (klon C-20, Santa Cruz, Heidelberg, Niemcy, i Genzyme, Cambridge, Mass.). Związane przeciwciała wykrywano za pomocą połączonej metody peroksydazy streptawidyna-biotyna (Dako), a reakcję enzymatyczną wizualizowano za pomocą 3-amino-etylokarbazolu (Dianova, Hamburg, Niemcy). Jako kontrolę negatywną zastosowano monoklonalną immunoglobulinę mysią. Hybrydyzacja In Situ
Antysensowne sondy jednoniciowego DNA amplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ze starterami 3 dla receptorów interleukiny typu I lub typu II.9 Sondy kontrolne zaprojektowano w ten sam sposób, stosując startery 5 . Wszystkie sondy oczyszczono za pomocą kolumn MicroSpin S-300 HR (Pharmacia Biotech, Heidelberg, Niemcy) i wyznakowano za pomocą reakcji, w której trifosforan deoksyadenozyny i trifosforan digoksyigenino-dezoksyuracylu dodano do końców 3 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy). . Sondy znakowane digoksygeniną hybrydyzowano do utrwalonych w kriostacie odcinków tkanki nowotworowej nadnercza, a sondę związaną z tkanką barwiono monoklonalnym przeciwciałem przeciwko digoksygeninie (Boehringer Mannheim). Skrawki zdrowej ludzkiej tkanki nadnerczy służyły jako kontrole.
Izolacja RNA i PCR z odwrotną transkrypcją
Całkowity RNA wyizolowano z 5 milionów komórek za pomocą zestawu RNAeasy Miniprep (Qiagen, Hilden, Niemcy). Komplementarny DNA (cDNA) zsyntetyzowano przez odwrotną transkrypcję (zestaw do syntezy pierwszej nici z gotową do użycia T-Ready, Pharmacia Biotech) po traktowaniu dezoksyrybonukleazą I (Boehringer Mannheim); cDNA dla receptora interleukiny typu I lub typu II zostało zamplifikowane, jak opisano wcześniej9. Produkty PCR receptorów interleukiny typu I i typu II zostały zweryfikowane przez trawienie MboII i MspI lub MboII i EcoRI (Promega, Heidelberg, Niemcy). Jako kontrola negatywna, genomowy DNA lub RNA, który nie był odwrotnie transkrybowany, przetwarzano równolegle.
Ekstrakcja DNA i analiza klonalności
DNA ekstrahowano z zamrożonej tkanki nowotworowej i limfocytów krwi obwodowej od pacjenta, jak opisano wcześniej. 10 Gen ludzkiego genu receptora androgenowego A (HUMARA, numer dostępu GenBank M21748) użyto do zidentyfikowania klonalnego pochodzenia gruczolaka.
Eksperymenty z komórkami-kulturami
Próbki guzów nadnerczy i prawidłową tkankę nadnerczy mechanicznie rozcięto i trawiono enzymatycznie. Po zubożeniu makrofagów monoklonalnym mysim przeciwciałem przeciwko CD68 (KP-1, Dako) i owczej antymodalnej immunoglobulinie Dynabeads M-450 (Dynal, Oslo, Norwegia), 12 izolowanych komórek hodowano w czterech powtórzeniach w 24-dołkowych płytkach (100 000 komórki na studzienkę) przez trzy dni, jak opisano poprzednio.13 Następnie komórki przemyto i inkubowano z 10-8 M do 10-12 M ludzkiej interleukiny-1. (Endogen, Cambridge, MA) lub 10-9 M kortykotropiną (Synacthen). , Ciba-Geigy, Wehr, Niemcy) w pożywce bez surowicy przez 6, 12 lub 24 godziny przed stężeniem kortyzolu mierzono testem radioimmunologicznym (Biermann, Bad Nauheim, Niemcy).
Wyniki
Badanie histologiczne
Badanie mikroskopowe gruczolaka nadnerczy pacjenta ujawniło dobrze unaczyniony guzek, który zawierał komórki gruczolaka bez oznak złośliwości i był silnie infiltrowany przez leukocyty.
Analiza immunohistochemiczna
Rysunek 1
[więcej w: wdrożenia magento, dronedaron, anakinra ]
[więcej w: węzły chłonne pachowe, wiązówka błotna, tussipico ]